澳门沙金在线平台官方网站if10+天中医：人参属草药多糖的多级指纹图谱和心肌细胞

　　澳门沙金在线平台官方网站if10+天中医：人参属草药多糖的多级指纹图谱和心肌细胞保护评估该研究聚焦人参属中药多糖组成与活性差异，以六种人参属中药（人参、红参、西洋参、三七、竹节参、珠子参）为研究对象，首次系统表征了多糖的度化学指纹谱与心肌细胞保护作用。六种人参属中药中多糖含量差异明显（红参中含量最高，三七中最低），分子量分布范围重叠度高；六种人参属中药多糖水解后的寡糖指纹谱相似度高，8种差异寡糖可有效区分三七与品种。红参多糖对OGD和OGD/R所致的H9c2细胞损伤有明显的保护作用以及线粒体功能增强的作用。该研究为人参属中药多糖的研究及开发利用提供了重要的依据。

　　作为草药或全球消费的保健品的重要来源，来自人参属的少数药用植物表现出显著的滋补作用。基于中医的基本理论，不同人参品种的性味归经存在差异，因此对各种人参来源的中药进行质量控制，以确保其在临床中的应用，具有至关重要的意义。然而，目前大多数关于人参质量分析的研究主要集中在人参皂苷上。除却皂苷，多糖也是一类人参属中含量丰富的药理生物活性大分子澳门沙金在线平台。从人参中鉴定出近80种多糖，其中葡聚糖（淀粉样）和果胶含量最为丰富。在药理方面，人参多糖已经被证实与抗氧化、抗糖尿病和免疫调节活性有关。鉴于多糖在人参质量控制中的作用被低估，因此迫切需要对从不同人参物种中提取的多糖进行化学和生物学方面的大规模比较研究。

　　分析技术的进步极大地促进了植物多糖在多层次的表征：粗多糖、部分水解低聚糖和完全水解单糖。由于多糖的分子量、极性和缺乏发色团，RID、CAD、ELSD、MALLS和 MS被广泛应用于多糖和水解产物。特别是可以测量分子量信息并提供定量测定结果的MALLS。首先，HPGPC和 HPSEC-MALLS-RID可实现整体多糖指纹识别[1]。其次，HILIC与ELSD或MS相结合可以促进基于MS信息的寡糖图谱和结构解析[2]。第三，优选使用PMP结合HPLC或GC-MS进行柱前衍生化，以分析完全水解的单糖[3]。此外，PACE和HPTLC适用于分离低聚糖。然而，迄今为止，很少有研究比较这三种不同聚合水平下不同人参之间的多糖差异。非靶向代谢组学是利用整体代谢物差异的有效载体，然而，寡糖分析很少使用。以六种人参属多糖的组成差异为案例可为临床常用的更多人参物种中多糖的大规模和整体比较提供方法学参考。

　　《中国药典（2020年版）》记载了7种人参属中药，分别涉及人参、人参叶、红参、西洋参、三七、竹节参、珠子参。 本研究旨在通过化学和生物学评价对6种根参药物（PG/PQ/PN/RG/ZJS/ZZS）的多糖进行大规模、多层次的比较研究。一方面，进行了三个层次的多糖表征：通过HPSEC-MALLS-RID进行整体多糖分析和比较;通过HILIC/IM-QTOF-HDMSE进行部分水解低聚糖指纹图的非靶向代谢组学;通过PMP衍生化和UHPLC-UV分析完全水解单糖分析。另一方面，利用H9c2细胞上的氧和葡萄糖剥夺（OGD）和氧葡萄糖剥夺/再灌注（OGD/R）两种体外细胞模型来比较不同人参多糖之间的生物活性差异[4]。我们希望简化多层次指纹图谱技术，使整体多糖比较成为可能，并提供新的证据，以支持除了通常关注的皂苷之外，生物大分子对人参的质量控制。

　　为了分析和揭示6种人参多糖的明显差异，提出了一种新的“反排阻范围表征”策略，即使用7根HPSEC色谱柱对PPG-QC/PPQ-QC/PPN-QC进行表征发现三种人参多糖都很好地保留在这七根色谱柱上，即使对于相同的多糖QC样品，这些色谱柱也能提供不同的特征（图1）。具有较大排阻范围的色谱柱（例如，Ultrahydrogel 2000、OHpak SB-805 HQ/804 HQ 和 TSK G4000 PWXL）可以很好地保留高质量的多糖，而TSK G3000 PWXL、OHpak SB-803 HQ 和 Ultrahydrogel 250 有助于对低质量多糖进行更精细的表征。TSK G4000 PWXL 和OHpak SB804 HQ表现出平衡的峰分布更适合人参多糖指纹图谱。经《中药色谱指纹相似性评价系统》评估的相似性显示，使用代表性样本（RG9）验证了已建立的HPSEC/malls/RID方法在日间/日内精度、重复性和线性方面均符合要求。这些结果可以证明一种强大的多糖指纹图谱方法适用于PG/PQ/PN/RG/ZJS/ZZS的整体多糖比较。

　　为了描述人参多糖的Mw特征，利用MALLS-RID检测得到的分子量分布（Mw/Mn）参数，包括Mw、Mn和PDI。图2直观地显示了种内分子分布变化。显然，这6种人参产品的4个分段Mw范围高度相似，重叠区域较宽，种内差异相对较大。相比之下，多批次的PG/PQ/PN/RG样品在Mw1之间表现出狭窄的变化，RG在Mw2和Mw3以及PQ/RG/ZZS的Mw4的结果相似。我们可以很容易地观察到使用单批样品在不同人参物种之间多糖的 Mw 分布差异，但是，基于多批次样品分析，实现完整的种间分化往往更加困难。

　　鉴于HILIC在分离寡糖方面的优异性能，我们寻求开发一种尺寸增强的HILIC / IM-QTOF-HDMSE方法，结合化学计量学，来分析和表征寡糖差异。通过比较可分离峰的数量和峰对称性，评估了五根HILIC色谱柱对寡糖分离的影响。显然，BEH Amide色谱柱可以分离比其他色谱柱更多的峰，同时实现良好的峰形（图S1A）。与醋酸铵作为添加剂相比，添加FA更适合于人参低聚糖的分离（图S1B）。毛细管电压（1.0–3.5 kV）的关键离子源参数对六种低聚糖的整体离子响应影响不大（图S1C），并选择3.0 kV时的电压。锥孔电压（20-100 V）的影响在很大程度上取决于化合物（图S1D），最终设定了 40 V 的电压。

　　图S1.优化 HILIC/IM-QTOF-MS 条件以检测来自各种人参样品的低聚糖。A: 固定相的选择通过显示基峰色谱图使用OQC1样品; B: 峰值在所选样品上使用两种不同的流动相获得的OQC1色谱图BEH酰胺柱; C和D:关键离子源参数的优化通过评估峰面积获得毛细管电压（1.0–3.5 kV）和锥孔电压（20–100 V）六种低聚糖

　　HILIC/IM-QTOF-HDMSE采用基于非靶向代谢组学对6种人参的粗多糖进行剖析和比较，并显示了单独的代表性低聚糖样品的基峰色谱图（BPC）。显然澳门沙金在线平台，目前的色谱条件可以在26分钟内对低聚糖的不同聚合进行良好的分离，但是，获得的不同人参物种的谱图相似。用PCA和OPLS-DA进行化学计量学分析的变量。在PCA的评分图中，QC数据的紧密聚类（图3A）证明了所建立方法可接受的稳定性。OPN样品与其他样品存在显著差异，OZJS/OZZS可与OPG/ORG部分分离。此外，通过OPLS-DA建模，将这3种人参分为OPN、OPG/ORG/OPQ和OZJS/OZZS三个部分（图3B），并通过了过拟合测试（图1D）。VIP图（截止值：1）可以揭示3个差分离子（图3C）。其中8种低聚(27#/31#/32#/36#/38#/41#/48#/57#)表现出更高的强度，可以诊断区分PN和其他低聚糖（图3E）。

　　图3.六种三一草药低聚糖代谢组学分析（A: PCA评分图;B: OPLS-DA的评分图;C: 121 个离子的投影 （VIP） 图中的可变重要性，截止设置为 1.0;D: 机会排列检验，以验证OPLS-DA模型是否存在过度拟合;E: 说明八个最重要的低聚糖标记物分布差异的箱形图。

　　图4.（A）阴性和阳性离子模式下HDMSE 获得的QC样品（OQC）低聚糖的基础峰色谱；（B）阴离子模式DP-6寡糖标志物MS2数据 。

　　由于高亲水性，传统的HPLC甚至HILIC都不能很好地分离单糖[4]。PMP衍生化结合HPLC-UV（在250nm处检测到）已被证明可用于高灵敏度分析单糖。为了追求高灵敏度和效率，检查了20种不同的反相UHPLC色谱柱，以评估PMP衍生化后分离混合单糖参比标准品的选择性和色谱柱效率（图S2）。相比之下，CORTECS UPLC C18色谱柱具有良好的保留和对称峰，特别是最后三个峰（Gal/Xyl/Ara）的最佳分离度，具有非常尖锐的峰。更高浓度的AA添加剂和更高的柱温可以显著加速UPLC C18色谱柱上寡糖的洗脱（图S3）。相比之下，在水相中添加50 mM AA和28 °C的温度提供了最佳性能，特别是在分离Gal/Xyl/Ara方面。此外，日内和日间精密度、重复性和稳定性（48 h）的测定范围分别为0.14–3.31%、1.01–6.08%、8.43–15.28%）和1.45–5.88%，这可能表明已建立的单糖指纹图谱方法精确且可重复，并且样品在48小时内稳定。

　　图S2.20种不同的2μm颗粒填充柱的比较混合单糖标准品的反相UHPLC分离效果。(乙腈/100 mM AA的流动相为使用，柱温度保持在30°C)

　　随后，将已建立和验证的UHPLC-UV方法应用于分析和比较6种人参属草药中的单糖组成。通过检测8种单糖的相对含量发现（Man/Rha/GlcA/GalA/Glc/Gal/Xyl/Ara;图5）Xyl和GalA分别仅从单个PN样品（PN1）和单个PG样品（PG10）中分别检测到；在RG中未观察到Man和GlcA。这些结果表明，PN和PG的多糖分别含有少量的Xyl和GalA，而Man和GlcA的缺失可能对识别RG具有诊断意义。此外，PG中Glc的含量特别高，PN中的Rha/Gal/Ara和RG中的GalA含量特别高（与其他五种相比），可能是区分这6种人参的潜在识别点。这些结果可能与我们利用的多糖提取方法（超声辅助热水提取）相关，通过该方法提取主要是中性多糖以及含少量的酸性多糖。

　　为了评估不同人参多糖的效果，在暴露于OGD之前，用9.2-12μg/mL的PPG（PPG5），PPQ（PPQ200），PPN（PPN7），PRG（PRG3），PZJS（PZJS7）或PZZS（PZZS3）处理 H9c2细胞48小时。与对照组相比，OGD孵育明显降低了细胞活力，而与OGD处理组相比，三种浓度（25、50和100 μg/mL）的PRG预处理可以显着提高细胞活力（图S4D）。此外，200μg/mL预处理48小时的PPQ略微提高了细胞活力（图S4B）。在我们测试了五种浓度的药物中，未观察到PPG（图S4A），PPN（图S4C），PZJS（图S7E）和PZZS（图S4F）的保护作用。在OGD / R模型中观察到类似的表型，与OGD / R组相比，PRG预处理（25，50和100μg/ mL）48小时明显提高了细胞活力。此外，PPN 为 100 和 200 μg/mL和100μg/mL的PPQ。与OGD / R组相比，S8B）预处理也提高了细胞活力。PPG，PZJS和PZZS在测试浓度内，对OGD/R模型没有起到保护作用。总的来说，PRG预处理对H9c2细胞中的OGD和OGD / R损伤具有显着的保护作用。

　　为了进一步分析PRG对OGD或OGD / R损伤的保护，使用Seahorse XFe9多功能能量代谢器和线粒体压力试剂盒测量未经处理和PRG处理2小时的H9c2细胞中的耗氧量。研究发现，在OGD诱导的损伤中，PRG孵育可以显着增加基础呼吸，最大呼吸能力和ATP相关呼吸（图6A和B）。对于OGD/R诱导的损伤，PRG仅增加ATP相关的呼吸，对线粒体应激下线粒体呼吸的其他参数没有影响（图6C和D）。因此，PRG可以挽救OGD或OGD/R诱导的H9c2细胞损伤，这可能取决于线粒体生物合成和功能的调节[5]。在OGD/R孵育前用25，50，100μg/ mLPRG预处理后，通过Mito-Tracker线细胞中的线粒体生物合成。我们注意到，与对照组相比，OGD/R孵育后丝图的强度显着降低，而PRG预处理组的强度在OGD/R孵育后显着增加（图6E）澳门沙金在线平台。因此，RG可以增强线细胞中OGD或OGD / R诱导的损伤。目前，来自不同人一物种的多糖的保护作用主要涉及抗肿瘤、抗氧化和免疫调节活性等。一项研究报告，来自 PG 的酸性多糖部分通过激活再灌注损伤挽救激酶和内皮一氧化氮合酶途径，对 H9c2 心肌细胞免受缺氧和复氧损伤具有保护作用。我们首次发现RG多糖可以通过调节线粒体功能来保护心肌细胞损伤免受缺氧诱导的损伤。PRG的潜在心脏保护功能和可能的机制将在未来的动物模型中进行研究。

　　为了充分发挥多糖在人参质量控制中的作用，通过化学和生物评价对6种人参草药中提取的多糖进行了大规模的比较。研究来自总多糖（HPSEC-MALLS-RID），部分水解低聚糖（HILIC/IM-QTOF-HDMSE）和完全水解的单糖（UHPLC-UV/PMP衍生化）的整体指纹图谱技术，有助于发现6种人参多糖的组成差异。此外，揭示了RG多糖对抑制OGD和OGD/R诱导损伤和促进线细胞中的保护作用。总之，新发现的证据为多糖作为众所周知的皂苷的重要补充在人参质量控制中的潜在作用提供了支持。这是第一份涉及对六种不同Panax草药的多糖进行同时化学和生物学比较的研究。

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